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              MLE-12細(xì)胞

              發(fā)布時(shí)間:2016-04-26瀏覽:2159次

              染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(Chromatin Immunoprecipitation,簡(jiǎn)稱ChIP)是研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的一種技術(shù)。它利用抗原抗體的特異性反應(yīng),可以真實(shí)地反映體內(nèi)蛋白分子與基因組DNA結(jié)合的狀況。下面我們就zui基本的實(shí)驗(yàn)步驟,實(shí)驗(yàn)中的小技巧以及需要注意的問(wèn)題簡(jiǎn)單介紹一下。

              1.  細(xì)胞固定

                  甲醛能有效的使蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)-DNA,蛋白質(zhì)-RNA交聯(lián),形成生物復(fù)合體,防止細(xì)胞內(nèi)組分的重新分布。交聯(lián)所用的甲醛終濃度為1%,交聯(lián)時(shí)間通常為5分鐘到1個(gè)小時(shí)。需注意的是,交聯(lián)時(shí)間如果過(guò)長(zhǎng),細(xì)胞染色質(zhì)難以用超聲波破碎,影響ChIP結(jié)果,而且實(shí)驗(yàn)材料也容易在離心過(guò)程中丟失。交聯(lián)時(shí)間如果過(guò)短,則交聯(lián)不*,產(chǎn)生假陰性。甲醛的交聯(lián)反應(yīng)可被加入的甘氨酸終止。

              2.  染色質(zhì)片段化

                  交聯(lián)后的染色質(zhì)需被超聲波切成400~600bp的片段,以便目的蛋白的暴露,利于抗體識(shí)別,其片段破碎的均勻一致性對(duì)結(jié)果影響至關(guān)重要。傳統(tǒng)的超聲波破碎是利用機(jī)械力斷裂染色質(zhì),容易引起升溫或產(chǎn)生泡沫,這都會(huì)引起蛋白質(zhì)變性,進(jìn)而影響ChIP的效率。而來(lái)自比利時(shí)的Bioruptor非接觸式超聲波破碎儀采用溫和的破碎方式,保證了蛋白的活性,DNA破碎效果均一,同時(shí)外接水循環(huán)儀保證了實(shí)驗(yàn)的溫度穩(wěn)定性,成為目前ChIP實(shí)驗(yàn)的。

              3.  染色質(zhì)免疫沉淀反應(yīng)

              Input對(duì)照:

              在進(jìn)行免疫沉淀前,需要取一部分?jǐn)嗔押蟮娜旧|(zhì)做Input對(duì)照。Input需要與沉淀后的樣品DNA一起經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)交聯(lián),DNA純化,以及zui后的檢測(cè)。Input對(duì)照不僅可以驗(yàn)證染色質(zhì)斷裂的效果,還可以根據(jù)Input中的靶序列的含量以及染色質(zhì)沉淀中的靶序列的含量,按照取樣比例換算出ChIP的效率,所以Input對(duì)照是ChIP實(shí)驗(yàn)*的步驟。

              Beads選擇:

              接下來(lái),利用目的蛋白質(zhì)的特異抗體通過(guò)抗原-抗體特異反應(yīng)形成DNA-蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合物,然后使用Agarose beads或Magnabeads沉淀此復(fù)合物,特異性地富集與目的蛋白結(jié)合的DNA片段。再經(jīng)過(guò)多次洗滌,除去非特異結(jié)合的染色質(zhì)后,用SDS+NaHCO3洗脫免疫沉淀復(fù)合物。

              抗體選擇:

              染色質(zhì)免疫沉淀所選擇的目的蛋白的抗體是ChIP實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。因?yàn)樵诘鞍踪|(zhì)與染色質(zhì)交聯(lián)結(jié)合時(shí),抗體的抗原表位可能因?yàn)榕c結(jié)合位點(diǎn)的距離太近,不能被抗體識(shí)別,所以不能有效地在體內(nèi)形成免疫沉淀復(fù)合物,直接影響ChIP的結(jié)果。

              陰性對(duì)照設(shè)置:

              在做ChIP實(shí)驗(yàn)時(shí),需設(shè)置對(duì)照,以便于對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性進(jìn)行評(píng)估。陽(yáng)性抗體和陰性抗體對(duì)照是zui基本的實(shí)驗(yàn)對(duì)照。陽(yáng)性抗體通常選擇與已知序列相結(jié)合的比較保守的蛋白的抗體,常用的包括組蛋白抗體或RNAPolymerase II抗體等。陰性抗體通常選擇目的蛋白抗體宿主的IgG或血清。目的蛋白抗體的結(jié)果與陽(yáng)性抗體和陰性抗體的結(jié)果相比較,才能得出正確結(jié)論。另外,還應(yīng)考慮目的蛋白抗體與DNA的非特異性結(jié)合的可能,所以通常還會(huì)選擇一對(duì)陰性引物,即目的蛋白肯定不會(huì)結(jié)合的DNA序列,作為該抗體的陰性對(duì)照。*的陰性對(duì)照引物是在靶序列上游的一段與目的蛋白肯定不能結(jié)合的序列。如果目的蛋白沒(méi)有商品化的適用于染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的抗體,只有其他用途的抗體時(shí),可以先做蛋白質(zhì)免疫沉淀檢測(cè)。如果抗體可以成功的沉淀蛋白,再進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)。

              4.  交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)和DNA的純化

              用不含DNase的RNase和Proteinase K,65℃保溫6小時(shí)逆轉(zhuǎn)交聯(lián),經(jīng)DNA純化柱回收DNA或用酚氯仿抽提、乙醇沉淀純化DNA。在逆轉(zhuǎn)交聯(lián)時(shí)不使用Proteinase K,然后用丙酮回收有機(jī)相中的蛋白質(zhì),進(jìn)行分析。

              5.  DNA的鑒定

              zui常用的DNA的鑒定方法是半定量PCR和Real-time PCR。由于啟動(dòng)子區(qū)域序列多樣性的特點(diǎn),所以不同的細(xì)胞系或不同的動(dòng)物品系的同一基因的啟動(dòng)子序列有可能不同,因此可設(shè)計(jì)多對(duì)引物來(lái)反復(fù)驗(yàn)證ChIP實(shí)驗(yàn)的結(jié)果.

              慧穎細(xì)胞庫(kù)400種類細(xì)胞株細(xì)胞系,20多株耐藥株,超低折扣,種類涵蓋:成纖維細(xì)胞 長(zhǎng)尾綠猴胚胎細(xì)胞 長(zhǎng)尾綠猴腎細(xì)胞 小鼠乳腺癌細(xì)胞 人膀胱癌細(xì)胞 人T細(xì)胞白血病細(xì)胞 人腎細(xì)胞腺癌細(xì)胞 人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞 人甲狀腺癌細(xì)胞 卵巢癌細(xì)胞 干細(xì)胞 結(jié)腸癌細(xì)胞 胃癌細(xì)胞 乳腺類細(xì)胞 等

              以下為購(gòu)買細(xì)胞系后的售后小知識(shí):

              1、CO2 培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔?

              定期(至少每?jī)芍芤淮危?以無(wú)菌蒸餾水或無(wú)菌去離子水更換之。

              2、為何培養(yǎng)基保存于4 ℃ 冰箱中, 顏色會(huì)偏暗紅色, 且pH值會(huì)越來(lái)越偏堿性?

              培養(yǎng)基保存于4 ℃ 冰箱中, 培養(yǎng)基內(nèi)之CO2 會(huì)逐漸溢出,造成培養(yǎng)基越來(lái)越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果, 將造成細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時(shí), 可以通入無(wú)菌過(guò)濾之CO2, 以調(diào)整pH 值。

              3、各種細(xì)胞培養(yǎng)用的dish,flask是否均相同?

              不同廠牌的dish 或flask, 其所coating 的polymer 不同, 制造程序亦不同, 雖對(duì)大部分細(xì)胞沒(méi)有太大之影響, 惟少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長(zhǎng)差異。

              4、購(gòu)買之細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后,為何會(huì)發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少之情形? 購(gòu)買之細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因?

              研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)存活率不佳, 常見(jiàn)原因可歸納為:培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過(guò)程錯(cuò)誤。冷凍細(xì)胞解凍后, 加以洗滌細(xì)胞和離心。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞。培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤。細(xì)胞置于–80℃太久。

              慧穎生物熱賣細(xì)胞代號(hào):OVCAR-5細(xì)胞,IMR-90細(xì)胞,A2780細(xì)胞,A2780/DDP細(xì)胞,SH-SY-5Y細(xì)胞,A431細(xì)胞,L Wnt-3A細(xì)胞,WRO細(xì)胞,IOSE80細(xì)胞,SW48細(xì)胞,COV434細(xì)胞,KGN細(xì)胞,SUM229PE細(xì)胞,SUM159PT細(xì)胞,SHIN3細(xì)胞,NCM460細(xì)胞,HFF細(xì)胞,HTR8-SVNEO細(xì)胞,MLE-12細(xì)胞,RS4:11細(xì)胞,HELF細(xì)胞,MRTEC細(xì)胞,HT-3細(xì)胞,LNCAP細(xì)胞,RAW264.7細(xì)胞等,MLE-12細(xì)胞。

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