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              MC3T3-E1 MC3T3-E1細(xì)胞株

              發(fā)布時(shí)間:2016-04-26瀏覽:1539次

              lncRNA 的研究已經(jīng)在世界范圍內(nèi)變得越愛越熱門,通過(guò)這些年的研究,lncRNA的機(jī)制研究也形成了一定的套路:

              1)高通量分析lncRNA的表達(dá);

              2)驗(yàn)證高通量篩選后的結(jié)果;

              3)研究lncRNA與蛋白之間的相互作用。

              接下來(lái)的文章中,慧穎生物會(huì)和大家一起討論lncRNA機(jī)制研究中常用的方法,歡迎小伙伴們積極參與討論。

              (一)高通量分析lncRNA 的表達(dá)

              隨著lncRNA研究的不斷深入,現(xiàn)在已經(jīng)有了很多很成熟的lncRNA芯片產(chǎn)品,可供選擇。另外二代測(cè)序的興起,也使得RNA-seq成為分析lncRNA表達(dá)譜的有效手段。當(dāng)然從費(fèi)用的角度講,lncRNA 的芯片更便宜,二代測(cè)序RNA-seq的成本更高。不過(guò)土豪請(qǐng)隨意!

              應(yīng)用lncRNA芯片或者RNA-seq進(jìn)行lncRNA表達(dá)譜分析的研究已經(jīng)有了很多。例如,Orom等人在人類的細(xì)胞系中通過(guò)lncRNA的芯片篩選,鑒定了3019lncRNA的表達(dá)分布。另外,Ng等通過(guò)定制化的lncRNA芯片(customized microarray)研究了人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cellhESCs)內(nèi)的lncRNA表達(dá)譜(expression profile)。他們發(fā)現(xiàn)有一些胚胎干細(xì)胞特異性的lncRNA對(duì)于維持干細(xì)胞的多能性(pluripotency)有非常重要的作用。在腫瘤研究(乳腺癌、胰腺癌、肝癌等)中,lncRNA芯片的應(yīng)用也是非常地廣泛。

              相對(duì)于lncRNA芯片在表達(dá)譜研究方面的廣泛應(yīng)用,RNA-seq方法的應(yīng)用領(lǐng)域則明顯地不同。RNA-seq 主要用于研究轉(zhuǎn)錄組。應(yīng)用該方法,獲得的結(jié)果受到的干擾信號(hào)(background signal)比較低,更重要的是,通過(guò)RNA-seq有可能獲得全新的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(當(dāng)然包括lncRNA在內(nèi),但是不局限于lncRNA。例如在腫瘤研究中,常用RNA-seq去發(fā)現(xiàn)新的融合基因。利用RNA-seq技術(shù),研究人員發(fā)現(xiàn)某些lncRNA分子在神經(jīng)精神疾病(neuropsychiatric disorder)中發(fā)揮重要作用。另有研究者通過(guò)RNA-seq技術(shù),分析了肝細(xì)胞癌(HCC)中的整個(gè)轉(zhuǎn)錄組,當(dāng)然也包括了lncRNA。

              (二)對(duì)于高通量數(shù)據(jù)的驗(yàn)證

              常用的驗(yàn)證高通量數(shù)據(jù)的實(shí)驗(yàn)手段有:Northern blotqRT-PCR、FISHRNAi 等方式。

              目前zui為常用的檢測(cè)lncRNA表達(dá)的手段是qRT-PCR,它的操作簡(jiǎn)單,自動(dòng)化程度高,在實(shí)驗(yàn)室普遍使用。FISH的實(shí)驗(yàn)方法,使用的實(shí)驗(yàn)室就相對(duì)較少。FISHNorthern 類似的地方是,它同樣是基于分子雜交的原理。使用FISH的一大優(yōu)勢(shì)是,它不僅可以表征lncRNA表達(dá)量的多少,更可以直觀地告訴研究者lncRNA在亞細(xì)胞/組織中的定位。

              研究者成功地使用該方法研究了多條lncRNA,包括Xist、MALAT1MENε/β和Kcnq1ot1等。RNAi是另一種廣泛使用的實(shí)驗(yàn)手段,在細(xì)胞中特異性地敲減lncRNA,是檢測(cè)lncRNA功能時(shí),zui常用的實(shí)驗(yàn)方法。例如,HOTAIR5'區(qū)域和3'區(qū)域可以分別結(jié)合PRC2LSD1,并起到一個(gè)腳手架(Scaffold)的作用。研究者通過(guò)RNAi的方式,敲減細(xì)胞內(nèi)源性HOTAIR分子,證實(shí)了該分子在結(jié)構(gòu)上的作用和功能。需要注意的是,以上的多種方法可以相互結(jié)合,以驗(yàn)證篩選獲得的lncRNA的表達(dá)及其可能發(fā)揮的功能。

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