lncRNA 的研究已經(jīng)在世界范圍內(nèi)變得越愛越熱門，通過(guò)這些年的研究，lncRNA的機(jī)制研究也形成了一定的套路：

1）高通量分析lncRNA的表達(dá)；

2）驗(yàn)證高通量篩選后的結(jié)果；

3）研究lncRNA與蛋白之間的相互作用。

接下來(lái)的文章中，慧穎生物會(huì)和大家一起討論lncRNA機(jī)制研究中常用的方法，歡迎小伙伴們積極參與討論。

（一）高通量分析lncRNA 的表達(dá)

隨著lncRNA研究的不斷深入，現(xiàn)在已經(jīng)有了很多很成熟的lncRNA芯片產(chǎn)品，可供選擇。另外二代測(cè)序的興起，也使得RNA-seq成為分析lncRNA表達(dá)譜的有效手段。當(dāng)然從費(fèi)用的角度講，lncRNA 的芯片更便宜，二代測(cè)序RNA-seq的成本更高。不過(guò)土豪請(qǐng)隨意！

應(yīng)用lncRNA芯片或者RNA-seq進(jìn)行lncRNA表達(dá)譜分析的研究已經(jīng)有了很多。例如，Orom等人在人類的細(xì)胞系中通過(guò)lncRNA的芯片篩選，鑒定了3019條lncRNA的表達(dá)分布。另外，Ng等通過(guò)定制化的lncRNA芯片（customized microarray）研究了人胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cell，hESCs）內(nèi)的lncRNA表達(dá)譜（expression profile）。他們發(fā)現(xiàn)有一些胚胎干細(xì)胞特異性的lncRNA對(duì)于維持干細(xì)胞的多能性（pluripotency）有非常重要的作用。在腫瘤研究（乳腺癌、胰腺癌、肝癌等）中，lncRNA芯片的應(yīng)用也是非常地廣泛。

相對(duì)于lncRNA芯片在表達(dá)譜研究方面的廣泛應(yīng)用，RNA-seq方法的應(yīng)用領(lǐng)域則明顯地不同。RNA-seq 主要用于研究轉(zhuǎn)錄組。應(yīng)用該方法，獲得的結(jié)果受到的干擾信號(hào)（background signal）比較低，更重要的是，通過(guò)RNA-seq有可能獲得全新的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（當(dāng)然包括lncRNA在內(nèi)，但是不局限于lncRNA。例如在腫瘤研究中，常用RNA-seq去發(fā)現(xiàn)新的融合基因。利用RNA-seq技術(shù)，研究人員發(fā)現(xiàn)某些lncRNA分子在神經(jīng)精神疾病（neuropsychiatric disorder）中發(fā)揮重要作用。另有研究者通過(guò)RNA-seq技術(shù)，分析了肝細(xì)胞癌（HCC）中的整個(gè)轉(zhuǎn)錄組，當(dāng)然也包括了lncRNA。

（二）對(duì)于高通量數(shù)據(jù)的驗(yàn)證

常用的驗(yàn)證高通量數(shù)據(jù)的實(shí)驗(yàn)手段有：Northern blot、qRT-PCR、FISH及RNAi 等方式。

目前zui為常用的檢測(cè)lncRNA表達(dá)的手段是qRT-PCR，它的操作簡(jiǎn)單，自動(dòng)化程度高，在實(shí)驗(yàn)室普遍使用。FISH的實(shí)驗(yàn)方法，使用的實(shí)驗(yàn)室就相對(duì)較少。FISH和Northern 類似的地方是，它同樣是基于分子雜交的原理。使用FISH的一大優(yōu)勢(shì)是，它不僅可以表征lncRNA表達(dá)量的多少，更可以直觀地告訴研究者lncRNA在亞細(xì)胞/組織中的定位。

研究者成功地使用該方法研究了多條lncRNA，包括Xist、MALAT1、MENε/β和Kcnq1ot1等。RNAi是另一種廣泛使用的實(shí)驗(yàn)手段，在細(xì)胞中特異性地敲減lncRNA，是檢測(cè)lncRNA功能時(shí)，zui常用的實(shí)驗(yàn)方法。例如，HOTAIR的5'區(qū)域和3'區(qū)域可以分別結(jié)合PRC2和LSD1，并起到一個(gè)腳手架（Scaffold）的作用。研究者通過(guò)RNAi的方式，敲減細(xì)胞內(nèi)源性HOTAIR分子，證實(shí)了該分子在結(jié)構(gòu)上的作用和功能。需要注意的是，以上的多種方法可以相互結(jié)合，以驗(yàn)證篩選獲得的lncRNA的表達(dá)及其可能發(fā)揮的功能。

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