收到細(xì)胞后如何正確地處理細(xì)胞

以下由@慧穎細(xì)胞庫(kù)從事細(xì)胞培養(yǎng)工作的人員總結(jié)給出的建議：
   有經(jīng)驗(yàn)和剛剛從事細(xì)胞培養(yǎng)工作的人員都應(yīng)該認(rèn)真仔細(xì)地詢問(wèn)下細(xì)胞提供方提供的建議，提前了解所要培養(yǎng)細(xì)胞的詳細(xì)資料，準(zhǔn)備好細(xì)胞所要用到的培養(yǎng)基和相關(guān)試劑，雖然所有的貼壁，半貼壁或者懸浮細(xì)胞處理方式差不多，但是不同的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件和處理力度還有試劑的批間差這些問(wèn)題存在，也會(huì)導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞處理不當(dāng)，或者環(huán)境的不適應(yīng)而造成細(xì)胞的死亡。
1.收到細(xì)胞，*時(shí)間要鏡檢：觀察細(xì)胞形態(tài)是否正常，對(duì)于貼壁細(xì)胞則要注意看貼壁情況是否很好 ，觀察細(xì)胞密度，有疑議及時(shí)咨提供細(xì)胞的技術(shù)人員。 由于運(yùn)輸?shù)臅r(shí)間或者溫度的變化，很多貼壁細(xì)胞在盛滿培養(yǎng)基的瓶子里生長(zhǎng)的狀態(tài)和平時(shí)會(huì)有點(diǎn)不一樣，主要是貼壁牢固問(wèn)題。比如293T，平時(shí)貼壁就不是很牢，在裝滿的培養(yǎng)基瓶子里面，會(huì)發(fā)生大片的脫落，細(xì)胞聚集在一起，但是細(xì)胞生長(zhǎng)還是正常的，通過(guò)離心收集，加以胰酶的消化，重新打散，又可以正常的貼壁生長(zhǎng)。細(xì)胞接種或傳代以后，實(shí)驗(yàn)者每天或至多間隔1～2d，要對(duì)細(xì)胞做常規(guī)性檢查。觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)情況以及培養(yǎng)的pH變化、有無(wú)污染等。根據(jù)細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化，做換液或傳代處理，如發(fā)現(xiàn)異常情況應(yīng)及時(shí)采取措施。
2.當(dāng)通過(guò)上一步的觀察，細(xì)胞初步?jīng)]有任何問(wèn)題時(shí)，進(jìn)行下一步操作。當(dāng)收到的細(xì)胞密達(dá)到80%左右時(shí)，則處理如下：棄除瓶中大部分培養(yǎng)基，僅保留5到10mL培養(yǎng)所需的常規(guī)培養(yǎng)基；或更換新鮮的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中，隨后每天觀察。 細(xì)胞在低于正常生長(zhǎng)溫度情況下，會(huì)調(diào)整為靜止期，或者慢速生長(zhǎng)期，必須恢復(fù)37度的環(huán)境至少3個(gè)小時(shí)左右，才能重新調(diào)整到接近對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的狀態(tài)，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行細(xì)胞的傳代會(huì)大大增加傳代的成功率，和細(xì)胞的存活率。生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，在一般顯微鏡下觀察時(shí)可見(jiàn)，細(xì)胞透明度大、折光性強(qiáng)、輪廓不清。細(xì)胞生長(zhǎng)不良時(shí)，輪廓增強(qiáng)，胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒狀物，細(xì)胞之間空隙加大，細(xì)胞形態(tài)可變得不規(guī)則甚至失去原有特點(diǎn)，如上皮細(xì)胞變成類上皮細(xì)胞等某些染料當(dāng)細(xì)胞死亡時(shí)能透過(guò)變性的胞膜與解體的細(xì)胞核DNA結(jié)合，而令其著色。因而常用臺(tái)盼藍(lán)（trypan blue） 鑒別細(xì)胞死活，活細(xì)胞不著色，死細(xì)胞核呈藍(lán)色。
3.如果經(jīng)*步觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞密度超過(guò)90%，并且細(xì)胞狀態(tài)很好時(shí)，則復(fù)溫后2個(gè)小時(shí)需要立即傳代。傳代的比例應(yīng)依據(jù)不同的細(xì)胞而定。對(duì)于生長(zhǎng)比較快，狀態(tài)穩(wěn)定，不易受外界影響的細(xì)胞可以一次多傳幾瓶；對(duì)于生長(zhǎng)較慢，細(xì)胞比較薄，狀態(tài)容易波動(dòng)的細(xì)胞類型，一次少傳些，保證每瓶細(xì)胞密度大些，便于穩(wěn)定生長(zhǎng)。至于一些比較陌生的細(xì)胞，*次處理也可以依照第二種情況。
細(xì)胞傳代操作：

操作間隔應(yīng)讓無(wú)菌操作臺(tái)運(yùn)轉(zhuǎn)10分鐘以上后，再進(jìn)行下一個(gè)細(xì)胞株之操作；無(wú)菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時(shí)放置，其它實(shí)驗(yàn)用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。實(shí)驗(yàn)用品以70%ethanol擦拭后才帶入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在抬面之中央無(wú)菌區(qū)域，勿在邊緣之非無(wú)菌區(qū)域操作。
1.吸除培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液。
2.加入無(wú)菌pbs洗液（5-8mL）輕輕潤(rùn)濕細(xì)胞，稀釋多余的培養(yǎng)基，之后吸走洗液，動(dòng)作要輕，不可吹打到細(xì)胞。
3.向瓶?jī)?nèi)加入含0.25%EDTA的胰蛋白酶混合液少許，以能覆滿瓶底為限。
4.置溫箱中2~5分鐘，一旦鏡檢發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大后，細(xì)胞變圓，比較松動(dòng)后，立即終止消化。
5.加入該細(xì)胞對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基6mL（T25培養(yǎng)瓶）或12mL（T75培養(yǎng)瓶）終止消化。
6.用吸管通過(guò)吸取的培養(yǎng)基輕輕反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，使之從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液。吹打時(shí)應(yīng)盡量以zui少的次數(shù)將細(xì)胞從壁上吹下，不僅要控制吹打的力度、次數(shù)，還要注意要將細(xì)胞盡可能吹成單個(gè)。這樣既能減少死細(xì)胞，又能便于細(xì)胞再次均勻貼壁生長(zhǎng)。
7.依據(jù)傳代比例，將細(xì)胞懸液分瓶，再補(bǔ)充培養(yǎng)基后，靜置于溫箱培養(yǎng)，直止貼壁。
 貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長(zhǎng)成致密單層后，繼續(xù)生長(zhǎng)的空間不足，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成份也消耗較多，同時(shí)代謝廢物也有較多堆積，需要分瓶培養(yǎng)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代擴(kuò)增。對(duì)于貼壁不太緊的細(xì)胞如293，可以直接吹散后分瓶。而對(duì)于貼壁較緊的細(xì)胞如CHO，則需要以胰酶消化后再吹散分瓶。以筆者的經(jīng)驗(yàn)，以輕吹或加培養(yǎng)液后輕搖可下較好，但對(duì)于經(jīng)驗(yàn)不太充分的實(shí)驗(yàn)者而言是較難判斷掌握的。
   胰酶消化的程度是一個(gè)關(guān)鍵：消化過(guò)度則對(duì)細(xì)胞的活性影響較大，并有部分細(xì)胞漂浮，隨棄去的胰酶流失;消化不足則細(xì)胞難于從瓶壁上吹下，反復(fù)吹打同樣也會(huì)損傷細(xì)胞活性。影響消化速度的因素較多，主要有胰酶溶液的活性(配制條件、凍存或4℃保存時(shí)間長(zhǎng)短、是否反復(fù)凍融、解凍后存放時(shí)間及溫度等)、消化時(shí)的溫度(氣溫、細(xì)胞培養(yǎng)瓶及胰酶溶液的溫度)以及所加胰酶溶液的多少等。含有EDTA的胰酶會(huì)比不含的消化能力強(qiáng)很多，不同細(xì)胞對(duì)消化液的敏感性也不同，比如HEP-G2人肝癌細(xì)胞，該細(xì)胞消化時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)10分鐘左右。 消化時(shí)間仔細(xì)去摸索一下，每過(guò)2分鐘鏡下觀察細(xì)胞是否變圓，記錄的時(shí)間，下一次操作參考之前的記錄來(lái)控制時(shí)間即可。對(duì)于懸浮細(xì)胞換液時(shí)只需要補(bǔ)液就行。
   懸浮細(xì)胞的傳代則不需要用胰酶消化，直接通過(guò)計(jì)數(shù)算好傳代的比例，直接分瓶，補(bǔ)液。有些懸浮細(xì)胞趨于成團(tuán)生長(zhǎng)，此時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，當(dāng)補(bǔ)液時(shí)，避免吹打。典型實(shí)例：jurkat就是成團(tuán)生長(zhǎng)。當(dāng)jurkat細(xì)胞密度比較大時(shí)，可將培養(yǎng)瓶豎直放置2分鐘左右，待大部分細(xì)胞沉下，吸走上層清液，補(bǔ)充等量的新鮮培養(yǎng)基。而 HL-60 就不一樣了，為懸浮單個(gè)生長(zhǎng)，如果發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞包團(tuán)，說(shuō)明細(xì)胞狀態(tài)不好，不加以正確的處理，zui終會(huì)發(fā)生凋亡。 

希望我們的建議能給您帶來(lái)幫助！