人IL-8定量分析酶聯(lián)免疫檢測試劑盒

IL-8簡介：

    IL-8是由巨噬細胞產(chǎn)生的單核因子，是趨化因子家族C-X-C亞族（α亞族）中的一員，對中性粒細胞、T淋巴細胞、嗜堿性粒細胞具有趨化作用，能夠吸附中性粒細胞，嗜堿性粒細胞和T細胞，但是單核細胞除外。人的IL-8 cDNA 序列表明有99個氨基酸殘基。經(jīng)過剪節(jié)掉22個個殘基后，形成成熟的具有77個氨基酸的蛋白。IL-8還能夠調(diào)節(jié)T淋巴細胞、B淋巴細胞成熟分化，在炎癥反應、免疫調(diào)節(jié)中起重要作用，并且研究表明IL-8還具有促進血管生成的作用。IL-8在人體內(nèi)存在兩種主要形式，一種是來源于單核細胞含72個氨基酸的多肽，另一種是來源于內(nèi)皮細胞含77個氨基酸的多肽。72aa比77aa的IL-8具有更高的趨化活性，而77aa的IL-8具有誘導白血病細胞凋亡的功能，其位于N端的五肽序列已被確定是IL-8具有誘導凋亡功能的活性部位。

檢測原理:

    本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法檢測樣本中IL-8 的濃度。IL-8 捕獲抗體已預包被于酶標板上，當加入標本或參考品時，其中的IL-8 會與捕獲抗體結(jié)合，其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。當加入生物素化的抗人IL-8 抗體后，抗人IL-8 抗體與IL-8 接合，形成夾心的免疫復合物，其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。隨后加入辣根過氧化物酶標記的親合素。生物素與親合素特異性結(jié)合，親合素連接的酶就會與夾心的免疫復合物連接起來；其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。zui后加入顯色劑，若樣本中存在IL-8 將會形成免疫復合物，辣根過氧化物酶會催化無色的顯色劑氧化成藍色物質(zhì)，在加入終止液后呈黃色。通過酶標儀檢測，讀其450nm處的OD值，IL-8 濃度與OD₄₅₀值之間呈正比，通過參考品繪制標準曲線，對照未知樣本中OD值，即可算出標本中IL-8 濃度。

人定量分析酶聯(lián)免疫檢測試劑盒組成:

標本收集:

1.標本的收集請按下列流程進行操作：

A.細胞上清標本離心去除懸浮物后即可；

B.血清標本應是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；

C.血漿標本，推薦用EDTA的方法收集；

D. 若待測樣本不能及時檢測，標本收集后請分裝，凍存于－20℃，避免反復凍融。

2.血清標本不應添加任何防腐劑或抗凝劑；

3.標本應清澈透明，檢測前樣本中如有懸浮物應通過離心去除；

4.請勿使用溶血，高血脂或污染的標本檢測，否則結(jié)果將不準確。

注：正常人血清或血漿樣本請用標本緩沖液做倍比稀釋后再檢測。

注意事項:

1.試劑盒請保存在2～8℃。

2.濃縮洗滌液因在低溫下可能有結(jié)晶，請水浴加熱使結(jié)晶*溶解后再配制工作液。

3.若標準品復溶后，請在三天內(nèi)用完。

4.底物請勿接觸氧化劑和金屬。

5.加樣時，請及時更換槍頭，避免交叉污染。

6.嚴禁混用不同批號的試劑盒組份。

7.充分混勻?qū)ΡＷC反應結(jié)果的準性很重要，在加液后請輕輕叩擊邊緣以保證混勻。

8.室溫反應，請嚴格控制在25～28℃。

9.洗滌過程是至關(guān)重要的，洗滌不充分會使度下降并導致結(jié)果誤差較大。

10.試驗中標準品和樣本檢測時建議作雙復孔。

11.加樣過程中避免氣泡的產(chǎn)生。

12.血清和血漿標本的檢測時，檢測抗體的孵育時間應適當延長。

檢測前準備工作:

1.試劑盒自冰箱中取出后應置室溫平衡20分鐘；每次檢測后剩余試劑請及時于2～8℃保存。

2.將濃縮洗滌液用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加19份水)。

3. 標準品:加入去離子水0.75ml至凍干標準品瓶中使IL-8終濃度達到2000pg/ml，靜置15分鐘后輕輕混懸待*溶解，用標準品稀釋液倍比梯度稀釋后依次加入檢測孔中。

洗滌方法:

自動洗板機或人工洗板：每孔洗滌液為300ul，注入與吸出間隔15-30秒。洗板5次。zui后一次洗板完成后將板倒扣著在厚吸水紙上用力拍干。

實驗過程需自備的材料：

1.不同規(guī)格的加樣槍及相應的槍頭；   2.酶標儀；       3．自動洗板機；      4．去離子水或雙蒸水；

操作步驟:

1.通過計算并確定一次性實驗所需的板條數(shù)，取出所需板條放置在框架內(nèi)，暫時用不到板條請放回鋁箔袋密封，保存于4℃。

2.建議設(shè)置本底較正孔，即空白孔,設(shè)置方法為該孔只加TMB顯色液和中止液。每次實驗均需做標準品對照并畫出標準曲線。

3.分別將標本或不同濃度標準品(100ul/孔)加入相應孔中，用封板膠紙封住反應孔，室溫孵育120分鐘。對于血清或血漿標本，請加入50ul樣本分析緩沖液后加50ul標本，如稀釋量大，請將樣本與樣本分析緩沖液等量加入，不足部分用標準品稀釋液補充至100ul。   

4.洗板5次，且zui后一次置厚吸水紙上拍干。

5.加入生物素化抗體工作液(100ul/孔)。用封板膠紙封住反應孔，室溫孵育60分鐘。  

6.洗板5次，且zui后一次置厚吸水紙上拍干。

7.加入酶結(jié)合物工作液(100ul/孔)。用封板膠紙封住反應孔，避光室溫孵育20分鐘。

8.洗板5次，且zui后一次置厚吸水紙上拍干。

9.加入顯色劑TMB100ul/孔，避光室溫孵育20分鐘。

10.加入終止液50ul/孔,混勻后即刻測量OD₄₅₀值。

結(jié)果判斷:

1.復孔的值在20%的差異范圍內(nèi)結(jié)果才有效，復孔的值平均后可作為測量值。

2.每個標準品或標本的OD值應減去本底校正孔的OD值。

3.手工繪制標準曲線。以標準品濃度作橫坐標，OD值作縱坐標，以平滑線連接各標準品的坐標點。通過標本的OD值可在標準曲線上查出其濃度。

4.若標本OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測，計算濃度時應乘以稀釋倍數(shù)。

典型數(shù)值和參考曲線