如何選擇抗體

1.定制單抗還是多抗？
首先應(yīng)該考慮的就是定制的抗體是應(yīng)用于什么實(shí)驗(yàn)，需要的量是多少？

對于科研用戶來說
1. 抗體常常應(yīng)用于WesternBlotting、IP等實(shí)驗(yàn)中，對于抗體的特異性有一定的要求，但并不是特別的強(qiáng)調(diào)
2. 往往在研究很多新的蛋白時，并不確定新蛋白是否很重要，是否會是將來很長一段時間的研究重點(diǎn)，所以抗體用量也不大所以針對科研用戶，在定制新的蛋白的抗體時，我們強(qiáng)烈建議首先制備多抗用于實(shí)驗(yàn)，當(dāng)?shù)玫搅死硐氲膶?shí)驗(yàn)結(jié)果并需要長期的使用該抗體時再考慮制備單抗。當(dāng)然，如果您對該抗體的特異性要求特別高（多抗的特異性已無法滿足實(shí)驗(yàn)要求，比如應(yīng)用于流式細(xì)胞術(shù)等）時，還是應(yīng)該定制單抗

對于工業(yè)用戶來說
1. 抗體往往應(yīng)用于檢測定量實(shí)驗(yàn)或者功能性實(shí)驗(yàn)，對于抗體的特異性要求非常之高
2. 目標(biāo)蛋白基本上都是已知的確定有相當(dāng)商業(yè)開發(fā)價值的，而且產(chǎn)品一旦形成，用量會非常大所以針對工業(yè)用戶，基本上可以直接定制單抗

2.該選多肽還是蛋白作為抗原呢？

需要根據(jù)抗體應(yīng)用于什么實(shí)驗(yàn)，以及您所能獲得的材料來決定
 
 1. 實(shí)驗(yàn)過程中蛋白處于天然狀態(tài)，這時使用的抗體識別的一般是蛋白的構(gòu)象表位和線性表位；這樣的實(shí)驗(yàn)主要有CO-IP、FACS、Neutralizing/Blocking以及Elisa法檢測天然蛋白等
2. 實(shí)驗(yàn)過程中蛋白處于變性或半變性狀態(tài)，這時大部分的構(gòu)象表位已被破壞，抗體識別的一般都是線性表位；這樣的實(shí)驗(yàn)主要有：Western、IHC/ICC/IF等以多肽作為抗原制備的抗體，識別的是線性表位，在使用時蛋白處于變性或半變性狀態(tài)下，結(jié)果可以令人滿意；但不能夠保證識別天然蛋白以蛋白作為抗原制備的抗體，識別蛋白的線性和構(gòu)象表位，基本上所有的實(shí)驗(yàn)都可以應(yīng)用，所以，用蛋白作為抗原應(yīng)是，但是在多肽抗原已可滿足實(shí)驗(yàn)要求而且得到蛋白有一定難度的情況下，以多肽作為抗原制備抗體更加合適。

3、什么情況應(yīng)該考慮用設(shè)計多肽做抗原？

答：如果氨基酸序列已知，但是由于基因克隆或表達(dá)等原因得不到抗原蛋白，或者僅需要得到針對抗原蛋白某幾個特定表位的抗體，就可以采用多肽合成的方式得到抗原。例如僅需要生產(chǎn)針對蛋白質(zhì)某個區(qū)域的特異抗體，比如研究蛋白質(zhì)N端的前體物，可以設(shè)計N末端的多肽抗原。如果抗體的使用目的是識別修飾的氨基酸，如磷酸化的絲氨酸、蘇氨酸或者酪氨酸，乙酰化賴氨酸等，就必須對多肽進(jìn)行相應(yīng)的修飾。一般情況下抗血清能夠識別用來免疫的多肽序列，但是不一定識別天然蛋白質(zhì)的折疊結(jié)構(gòu)。非連續(xù)性抗原的抗體能否識別抗原決定簇取決于用于抗體生產(chǎn)的多肽是否存在二級結(jié)構(gòu)。

4、設(shè)計多肽做抗原時的幾點(diǎn)基本原則？

答：識別區(qū)域的選擇原則一般說來的抗原性識別區(qū)域應(yīng)具備親水、位于蛋白表面和結(jié)構(gòu)上易變形性等特點(diǎn)。既要考慮其免疫原性、特異性，還需考慮其合成難度等。通常有以下幾點(diǎn)建議：1、序列長度在8-20個氨基酸殘基之間（如果太短，就有多肽太特殊、所產(chǎn)生的抗體與天然蛋白之間的親和力（結(jié)合能力）不夠強(qiáng)的風(fēng)險，同樣，如果序列長度超過20，將有可能引入二級結(jié)構(gòu)，所產(chǎn)生的抗體失去特異性的可能，而且肽鏈越長，通常合成難度增大，不易獲得高純度的產(chǎn)品）；2、盡可能是在蛋白表面；3、保證該段序列不形成α-helix；4、N，C端的肽段比中間的肽段更好；避免蛋白內(nèi)部重復(fù)或接近重復(fù)段的序列；5、避免同源性太強(qiáng)的肽段；6、交聯(lián)可以交聯(lián)在N，C兩端，選擇依據(jù)就是交聯(lián)在對產(chǎn)生抗體不太重要的一端；7、序列中不能有太多的Pro，但有一兩個Pro有好處，可以使肽鏈結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定一些，對產(chǎn)生特異性抗體有益。

5、原核表達(dá)含GST標(biāo)簽的蛋白制備抗體時，需要切掉GST標(biāo)簽嗎？

答：如果目的蛋白很大且之后的實(shí)驗(yàn)不受GST影響的話，GST標(biāo)簽是不用切掉的。但是如果目的蛋白小于20KD的話，建議通過實(shí)驗(yàn)切除GST標(biāo)簽。

6、抗體的保存：

答：小包分批，避免多次反復(fù)凍融。短期：4度冰箱保存。長期：-20度，一般需要加入甘油，BSA等。

7、關(guān)于抗原的常識

對抗原的要求是純度越高越好，尤其是初次免疫所用的抗原。如為細(xì)胞抗原，可取1×107個細(xì)胞作腹腔免疫?？扇苄钥乖杓?福氏佐劑并經(jīng)充分乳化，如為聚丙烯酰胺電泳純化的抗原，可將抗原所在的電泳條帶切下，研磨后直接用以動物免疫。還有一些半抗原，如多肽，在免疫之前是需要耦聯(lián)一些蛋白，如KLH，BSA等。病毒類的抗原，可以直接用于免疫。如果是蛋白，一般來說，蛋白的純度要在90％以上，濃度在1mg/ml以上，分子量>10kd。一般融解在無毒的緩沖液中，建議溶解在PBS中

1. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)

ELISA、熒光免疫組化的抗原可能是線性表位，也可能是構(gòu)象表位；而石蠟切片酶免疫組化、WB實(shí)驗(yàn)過程中涉及蛋白變性，因此只能用識別線性表位的抗體，如果用ELISA、熒光免疫組化抗體不一定有反應(yīng)。

2. 根據(jù)你的標(biāo)本的物種來源  

如來源于人，抗體就選鼠抗人、兔抗人…

一抗要與二抗相匹配，如果一抗是小鼠來源，那二抗就買抗小鼠的；一抗是兔來源，二抗就要抗兔的。例如，檢測人組織細(xì)胞因子IL-4，一抗假如是mouse抗人（來源于mouse），二抗就用兔或羊或大鼠等抗mouse的;

3. 抗整個分子還是抗某個亞基

如一些受體分子由不同亞基組成，需要用不同單抗；

4. 單克隆or多克隆抗體

單克隆抗體特異性強(qiáng)，但親和力相對小，檢測抗原靈敏度相對低；多克隆抗體特異性稍弱，親和力強(qiáng)，靈敏度高，但易出現(xiàn)非特異性染色.

表達(dá)量相對較高的抗原，盡量選擇單克隆抗體；不明確表達(dá)量情況，且有經(jīng)濟(jì)限制和時間限制的情況，可以選擇多克隆抗體。