牛血清白蛋白的鑒定

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/span>

通過(guò)牛血清清蛋白的提取與鑒定，掌握鹽析、離心、透析、電泳、及呈色反應(yīng)的原理及應(yīng)用。

實(shí)驗(yàn)原理：

   應(yīng)用相同濃度硫酸銨反復(fù)鹽析法，將血清中的清蛋白與其他球蛋白分離，再利用透析法除鹽，即可提取清蛋白。再利用電泳技術(shù)，即可對(duì)牛血清清蛋白進(jìn)行分離與鑒定。

實(shí)驗(yàn)步驟：

1.鹽析  取離心管一支加入牛血清待測(cè)液2 ml、加入等量PBS（磷酸鹽緩沖生理鹽水）稀釋血清，搖勻后，逐滴加入pH7.2飽和硫酸銨溶液4 ml，邊加邊搖，然后再2000 r/min離心10 min，將上清液倒入試管中，留供后面實(shí)驗(yàn)用。

2.透析  去玻璃紙（15cm*15cm）一張，折成袋形，將前面*次鹽析得到的含清蛋白的上清液倒入袋內(nèi)，用線繩扎緊上口（注意要留有空隙），使透析袋下半部浸入盛有半杯蒸餾水中，對(duì)蛋白液進(jìn)行透析，并用玻璃棒攪拌袋外液體，以縮短透析時(shí)間。還應(yīng)經(jīng)常換水，并用納氏試劑檢查袋外液體的NH₄⁺，觀察顏色變化，直至袋內(nèi)NH₄⁺透析完畢。將袋內(nèi)液體倒入試管，既得牛血清清蛋白溶液。

3.電泳 

①.點(diǎn)樣 取一條2.5cm*8cm膜條，將無(wú)光澤面向下，放入培養(yǎng)皿中的巴比妥緩沖液中使膜條充分浸透，取出，用干凈濾紙吸去多余的緩沖液，以醋纖膜的無(wú)光澤面距一端1.5 cm處作為點(diǎn)樣線，將牛血清樣品與待測(cè)的牛血清清蛋白溶液分別用點(diǎn)樣器在同一張薄膜的點(diǎn)樣線處不同位置點(diǎn)樣。

②.電泳 將點(diǎn)樣后的膜條置于電泳槽架上，放置時(shí)無(wú)光澤面（即點(diǎn)樣面）向下，點(diǎn)樣端置于陰極，待平衡5 min后，即可通電。用160伏電壓通電60分鐘，通電完畢后，用鑷子將膜條取出。

③.染色  將膜條直接浸于盛有氨基黑10B的染液中，染2 min取出，立即浸于漂洗液中，分別在漂洗液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各漂洗5 min，直至背景漂凈為止，用濾紙吸干薄膜。

4.鑒定  比較樣品與待測(cè)液中清蛋白在薄膜上的電泳結(jié)果，比較位置是否一致。

預(yù)期結(jié)果：如果醋纖膜上的色帶位置一致，則說(shuō)明提取的清蛋白得到了純化；若在待測(cè)液的電泳結(jié)果中出現(xiàn)其他球蛋白的色帶區(qū)域，則說(shuō)明清蛋白的提取不夠純。

實(shí)驗(yàn)儀器：

實(shí)驗(yàn)試劑：

附表：

    PBS試劑：用0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH7.2）配制的0.9% NaCl 溶液。

    pH7.2飽和硫酸銨：用濃氨水將飽和硫酸銨溶液調(diào)到pH7.2。

    漂洗液：95%乙醇45 ml，冰醋酸5 ml，蒸餾水50 ml。

    氨基黑10B 染色液：氨基黑10B 0.5g,甲醇50 ml,冰醋酸10 ml,蒸餾水40 ml。

巴比妥緩沖液：巴比妥鈉12.76g,巴比妥1.66g，用少量蒸餾水加熱溶解后，再加水稀釋至1000 ml。

納氏試劑：溶解碘化鉀30g于蒸餾水20ml內(nèi)，再加入碘22.5g振搖使其溶解。于此碘液內(nèi)加入純汞30g，用力搖振之，待溫度升高時(shí)，將燒瓶浸于冷水內(nèi)，并繼續(xù)搖勻，直到暗棕碘色轉(zhuǎn)變?yōu)榈S綠色為止。將上層溶液傾出，置于量筒內(nèi)，并以蒸餾水少許洗滌燒瓶，將洗滌液一并傾入。吸取此配成之溶液1到2滴，加入1%可溶性淀粉溶液1 ml內(nèi)，以試驗(yàn)有無(wú)多余的碘存在，如不顯藍(lán)色（即無(wú)多余碘存在），可加入碘液（碘化鉀3g，碘2.5g溶于蒸餾水10 ml內(nèi)配成）數(shù)滴于配成之溶液內(nèi)，直至此液加于淀粉溶液內(nèi)初顯藍(lán)色為止；將此液以蒸餾水稀釋至200 ml，加10%氫氧化鈉溶液975 ml，混合，即成納氏試劑。試劑新配成呈現(xiàn)混濁，靜置數(shù)日，待其沉淀，再吸上清液供用。