小鼠_TNF-α_elisa試劑盒說(shuō)明書(shū)

本試劑盒僅供研究使用

檢測(cè)范圍：31.2 pg/ml - 2000 pg/ml

zui低檢測(cè)限：7.8 pg/ml

特異性：本試劑盒可同時(shí)檢測(cè)天然或重組的小鼠TNF-α，且與其他相關(guān)蛋白無(wú)交叉反應(yīng)。

有效期：6 個(gè)月

預(yù)期應(yīng)用：ELISA 法定量測(cè)定小鼠血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中TNF-α

含量。

說(shuō)明

1．試劑盒保存：-20℃(較長(zhǎng)時(shí)間不用時(shí))；2-8℃(頻繁使用時(shí))。

2．濃洗滌液低溫保存會(huì)有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。

3．中、英文說(shuō)明書(shū)可能會(huì)有不一致之處，請(qǐng)以英文說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。

4．剛開(kāi)啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)含有少許水樣物質(zhì)，此為正常現(xiàn)象，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任

何影響。

概述

腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)是一種具有多種生物活性的細(xì)胞因子。兔子TNF-α

基因編碼前體蛋白，其信號(hào)肽將前體蛋白固定在細(xì)胞膜上，成為具有活性的跨膜干擾素

(TNF)，分子質(zhì)量為26×103，經(jīng)酶切去除信號(hào)肽生成分泌型TNF-α，分子質(zhì)量為17×103。

TNF-α細(xì)胞來(lái)源廣泛，包括各種免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、表皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、

平滑肌細(xì)胞、星形細(xì)胞、成骨細(xì)胞等。

TNF-α具有廣泛的生物學(xué)活性，如：參與炎性反應(yīng)和免疫應(yīng)答，抗腫瘤，參與內(nèi)毒素性休

克等病理過(guò)程，引起惡病質(zhì)等。其具有雙重作用，,一方面在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)，機(jī)體生理功能

和抗感染等方面發(fā)揮重要作用，另一方面若持續(xù)釋放或產(chǎn)生過(guò)多則會(huì)引起發(fā)熱!、休克、惡

病質(zhì)等，同時(shí)TNF-α可進(jìn)一步誘導(dǎo)IL-6、IL-8、IL-10 等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，這些促炎性細(xì)胞

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因子參與體內(nèi)急性反應(yīng)、發(fā)熱反應(yīng)、引起趨化肽釋放等，還可使內(nèi)皮細(xì)胞活化而導(dǎo)致血管通

透性增加。

實(shí)驗(yàn)原理

用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗TNF-α抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)

準(zhǔn)品、生物素化的抗TNF-α抗體、HRP 標(biāo)記的親和素，經(jīng)過(guò)*洗滌后用底物TMB 顯色。

TMB 在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺

和樣品中的TNF-α呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD 值)，計(jì)算樣品濃

度。

試劑盒組成及試劑配制

1. 酶聯(lián)板(Assay plate )：一塊(96 孔)。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品(Standard)：2 瓶(凍干品)。

3. 樣品稀釋液(Sample Diluent)：1×20ml/瓶。

4. 生物素標(biāo)記抗體稀釋液(Biotin-antibody Diluent)：1×10ml/瓶。

5. 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液(HRP-avidin Diluent)：1×10ml/瓶。

6. 生物素標(biāo)記抗體(Biotin-antibody)：1×120ul/瓶(1：100)

7. 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素(HRP-avidin)：1×120ul/瓶(1：100)

8. 底物溶液(TMB Substrate)：1×10ml/瓶。

9. 濃洗滌液(Wash Buffer)：1×20ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25 倍。

10. 終止液(Stop Solution)：1×10ml/瓶(2N H2SO4)。

需要而未提供的試劑和器材

1. 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀

2. 高速離心機(jī)

3. 電熱恒溫培養(yǎng)箱

4. 干凈的試管和Eppendof 管

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5. 系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測(cè)樣品較多時(shí)，用多通道移液器

6. 蒸餾水，容量瓶等

標(biāo)本的采集及保存

1. 血清：全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2 小時(shí)或4℃一夜后于1000 x g 離心20 分鐘，取上清即可

檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2. 血漿：可用EDTA 或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30 分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g 離心15

分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：請(qǐng)1000 x g 離心20 分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本

放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注：標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。

標(biāo)本的稀釋原則：

首先通過(guò)文獻(xiàn)檢索的方式了解待測(cè)樣本的大致含量，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至標(biāo)準(zhǔn)

曲線的范圍內(nèi)，檢測(cè)的結(jié)果才是準(zhǔn)確的。稀釋的過(guò)程中，應(yīng)做好詳細(xì)的記錄。zui后計(jì)算濃度

時(shí)，稀釋了“N”倍，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N”。

標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則：2 瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10 分鐘以上，

然后反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為2000 pg/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋2000

pg/ml，1000 pg/ml，500 pg/ml，250 pg/ml，125 pg/ml，62.5 pg/ml，31.2 pg/ml，樣品稀釋液

直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 pg/ml，臨用前15 分鐘內(nèi)配制。

如配制1000 pg/ml 標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml(不要少于0.5ml)2000 pg/ml 的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含0.5ml

樣品稀釋液的Eppendorf 管中，混勻即可，其余濃度以此類(lèi)推。

生物素標(biāo)記抗體的稀釋原則：

臨用前以生物素標(biāo)記抗體稀釋液稀釋?zhuān)♂屒案鶕?jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制

(每孔100ul)，實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10ul 生物素標(biāo)記抗體加990ul 生物素標(biāo)

記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。

辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則：

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臨用前以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液稀釋?zhuān)♂屒案鶕?jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的

總量配制(每孔100ul)，實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10ul 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和

素加990ul 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)

配制。

操作步驟

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，請(qǐng)?zhí)崆芭渲煤盟性噭噭┗驑悠废♂寱r(shí)，均需混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡。

每次檢測(cè)都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過(guò)高時(shí)，用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋?zhuān)允箻悠贩显?/span>

劑盒的檢測(cè)范圍。

1. 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?/span>100ul，余孔分別加標(biāo)

準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100ul，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，

輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120 分鐘。

為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液100ul(取1ul 生物素標(biāo)記抗

體加99ul 生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制)，37℃,60

分鐘。

3. 溫育60 分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3 次，每次浸泡1-2 分鐘，350ul/每孔，甩干。

4. 每孔加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液(同生物素標(biāo)記抗體工作液) 100ul，37℃，60

分鐘。

5. 溫育60 分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5 次，每次浸泡1-2 分鐘，350ul/每孔，甩干。

6. 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色(30 分鐘內(nèi)，此時(shí)肉眼可見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4 孔

有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4 孔梯度不明顯，即可終止)。

7. 依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。終止液的加入順序應(yīng)盡量與

底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。

8. 用酶聯(lián)儀在450nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度(OD 值)。在加終止液后15 分鐘以?xún)?nèi)進(jìn)

行檢測(cè)。

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注：

1. 用戶在初次使用試劑盒時(shí)，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。

2. 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H2SO4。

測(cè)量時(shí)先用此孔調(diào)OD 值至零。

3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。

4. 未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請(qǐng)于2-8℃保存。標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體工作液、辣根過(guò)

氧化物酶標(biāo)記親和素工作液請(qǐng)依據(jù)所需的量配置使用。請(qǐng)勿重復(fù)使用已稀釋過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)品、生

物素標(biāo)記抗體工作液或、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液。

5. 建議檢測(cè)樣品時(shí)均設(shè)雙孔測(cè)定，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

洗板方法

手工洗板方法：吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙，

酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml 注入孔內(nèi)，浸泡1-2 分鐘。根據(jù)需

要，重復(fù)此過(guò)程數(shù)次。

自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過(guò)程中。

計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)(對(duì)數(shù)坐標(biāo))，OD 值為縱坐標(biāo)(普通坐標(biāo))，在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上

繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)

物的濃度與OD 值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD 值代入方程式，計(jì)算出

樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

注意事項(xiàng)

1. 當(dāng)混合蛋白溶液時(shí)應(yīng)盡量輕緩，避免起泡。

2. 洗滌過(guò)程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽(yáng)性。

3. 一次加樣時(shí)間控制在5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

4. 請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。

5. 如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高，請(qǐng)先稀釋后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以稀釋倍數(shù)。

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6. 在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液工作液時(shí)，請(qǐng)以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。

7. 底物請(qǐng)避光保存。

8. 不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。

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