大鼠神經元細胞的原代培養(yǎng)

原代培養(yǎng)的細胞會不可避免地存留少量異質細胞一同生長．為了后續(xù)實驗結果的針對性和準確性，一般都需要對培養(yǎng)物進行純化。純化神經元的方法有很多種，zui簡便及常用的是采用有絲分裂抑制劑阿糖胞苷來抑制異質細胞的存活和生長。神經元的分化增殖完成于胚胎期，大部分神經元在出生后即為*的分裂后細胞，但其他細胞則仍然不斷地進行分裂增殖，

使用有絲分裂抑制劑后，非神經元的細胞生長會受到抑制及淘汰，神經元由此得到純化

實驗材料：Hanks液，DMEM培養(yǎng)基10ml，有刻度吸管兩只，彎頭吸管兩只，無刻度吸管一只，新生乳鼠（24小時）0.05%胰酶，1%雙抗，10%胎牛血清，培養(yǎng)皿，小燒杯，空的離心管，鑷子，剪刀，酒精燈，酒精棉，

實驗前準備工作：肥皂洗手，新吉爾滅擦手，開通風柜，將吸管從套筒中取出放入各自對應的試管內，將橡皮塞安裝到各自吸管上，酒精燈分別迅速灼燒，

1配液Hanks液近40ml加1%雙抗1ml，加完雙抗的小吸管留作計數(shù)，在DMEM培養(yǎng)基中加10%胎牛血清（已配好，全部加入），從離心管取一滴碳酸氫鈉調節(jié)pH值至溶液呈紫色，一離心管0.05%胰酶，

2.取材。乳鼠新生24小時。

3，洗滌剪碎，在培養(yǎng)皿中加入少許Hanks液洗滌，將乳鼠頭部用酒精棉擦拭消毒，在乳鼠頭部位置剪一個工字型切口，將皮膚顱骨沿著切口依次剪開剝離，取出大腦組織，并去除乳鼠的血管腦膜，用彎頭吸管將Hanks液與剝離干凈的腦組織移走到另一個干凈的培養(yǎng)皿中，用彎頭吸管洗走洗液，彎頭吸管將含有腦組織的Hanks移入到小燒杯中剪碎，每個組織塊近似一立方毫米，靜置后洗走上面的Hanks液，（吸取Hanks液時勿將下面的組織塊洗走），同樣方法再用Hanks液洗滌一次

4．酶解，加一離心管0.05%胰酶，將上述小燒杯中的組織液移入空置的離心管中，37攝氏度水浴10分鐘，觀察組織塊是否變小，靜置2分鐘，使組織沉淀下來，棄掉上請胰酶后，加DMEM培養(yǎng)基（全部倒入）來中和胰酶，吹散組織液

5.離心1200轉每分鐘，離心5分鐘，棄掉上清液，沉淀后加Hanks液吹散重懸組織液，用同樣的轉速和時間在離心一次，加*培養(yǎng)基3-4mL吹散，靜置1分鐘，以便消化大塊組織

6.計數(shù)，取0.1ml離心后的細胞液加入苔盤藍染色，加樣搶加0.1微升與計數(shù)板計數(shù)，同時剩余細胞液加入培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)接種，標注好組別和時間，培養(yǎng)細胞的名稱37攝氏度，二氧化碳培養(yǎng)箱中，下周實驗課觀察細胞培養(yǎng)情況。

7.計數(shù)結果：2.3×10⁶ ml

注意事項：

1. 實驗前保證乳鼠在冰塊內冰凍數(shù)分鐘，頭朝下將乳鼠插入冰塊內，
2. 玻璃腦膜血管時動作要迅速，以免乳鼠蘇醒
3. 酒精燈應放在離操作界面不遠處，保證其溫度
4. 用彎頭吸管吸取Hanks液時手腕旋轉
5. 第二遍在小燒杯中用Hanks液洗時，要保證上請洗干凈，否則胰酶濃度將會減低
6. *次水浴加熱時唔超過10分鐘，以免胰酶對組織產生損傷
7. 吹打時避免大力以及吹打出氣泡，氣泡會導
8. 致細胞破裂。吹打頻率可與秒表同步以保證每次操作的穩(wěn)定性和重復性。